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大鼠主动脉内皮细胞的分离培养

方法：分离大鼠主动脉，直接贴壁于培养皿中，荧光倒置显微镜观察细胞形态，免yi组化Ⅷ因子相关抗原染色鉴定细胞.结果:约24小时组织块边缘有游离的 新生细胞长出，7天即融合成片.消化传代后细胞呈短梭形或三角形，单层生长，铺路石状，Ⅷ因子表达阳性，呈指数增殖.冻存后复苏细胞活性均**过90%.结 论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法，冻存细胞存活率高，为体外研究提供了稳定的模型.

小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行破 骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一 步采用RT- PCR对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和组织蛋白酶K (Cathepsin K )的表达进行检测结果共培养5天后可观TRAP(+)多核细胞形成13天TRAP(+ )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现，随着培养时间的延长，细胞实验外包费用，陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因TRAP在共培养3天时开始表达，而MMP-9和Cathepsin K则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用显著诱导的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.

透射电镜自噬小体检测

胰酶消化，收集作用后的细胞，细胞实验外包收费，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中过夜。

再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后**薄切片用铜网固定，细胞实验外包价格，后用重金属醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过TEM分析凋亡细胞内**微结构变化，拍照保存。

贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，南京细胞实验外包，100-1500/mim 5 10min。离心完毕倒出培养液。管底的细胞团不要打散， 沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h. 也可在4C冰箱过夜。